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crispr文库筛选/crispr  library screening

crispr文库筛选/crispr library screening价格-博天堂备用

价格: ¥30000 - 100000

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文献和实验

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提供商:
广州艾迪基因
服务名称:
文库筛选
规格:

技术背景

研究基因功能和调控需要在模式生物对基因进行高通量的改变。通过改变基因,然后筛选所需要表型的生物,并通过测序找到影响表型的相关基因。传统的方法包括化学诱变和rna干扰,但是化学诱变受限于成本,rna干扰又不能实现完全敲除以及高脱靶性,影响了高通量基因筛选的进展。
crispr/cas9技术可以较容易的实现基因的完全敲除或激活,建立基因与表型的确定关系,成为大规模的基因筛选的最佳方案。

crispr/cas9文库筛选原理:

利用高通量的sgrna筛选文库,crispr/cas9技术实现高通量的基因敲除,获得不同基因编辑的细胞,包括获得新功能(gof,gain of funciton 和lof,loss of function),并探究这些基因的生物学意义。
相比之下,混合文库筛选成本低、操作简单且可用于体内研究,能够更全面地覆盖全基因组,侵染的细胞可在长期培养后检测结果。 crispr 文库多使用混合文库形式进行高通量筛选。

crispr/cas9文库筛选的用途:

筛选功能基因和耐药基因

crispr/cas9文库筛选的操作流程:


1.设计合成sgrna文库
对于高通量筛选,文库的大小是影响筛选结果的关键因素之一。全基因组文库通常包含超过10万个sgrna,一方面可以识别更多感兴趣的基因,但另一方面也会耗费大量时间和金钱(艾迪基因一般使用张峰的人类全基因组文库)。

对于其他相关通路基因则可以选择合成混合文库或者阵列文库。
2.构建稳定表达cas9蛋白的相应细胞株
3.慢病毒载体的构建及感染宿主细胞
crispr/cas9高通量文库筛选方法中,最关键的步骤是构建慢病毒载体。将sgrna文库进行慢病毒包装,并以较低的病毒感染复数转导至cas9表达细胞系,确保每个细胞只进入1个病毒,从而实现针对不同sgrna相对应基因的功能筛选。

4.阳性或阴性筛选筛选
工作的另一项重要步骤是选择恰当的筛选策略,比如加药处理。根据研究目的不同,crispr高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。

5.高通量测序与生信分析
利用生物信息学方法寻找候选基因,排除假阳性或假阴性筛选结果。从所选的细胞亚群中提取基因组dna,dna模板应足量以保证文库的丰度。在提取基因组dna后对sgrna的靶向区域进行pcr扩增,随后对这些区域进行高通量测序以量化它们的相对丰度。根据筛选前后的sgrna相对丰度变化确定sgrna是被富集还是消耗,从而确定基因型与表型之间的关系。利用生物信息学工具可通过评估同一基因中多个sgrna的富集水平来确定某一基因是否在相同背景下显著富集。

6.验证候选基因
用crispr/cas9技术筛选出若干个候选基因后,需要通过一系列方法进行验证,从而鉴定出调控特定表型的功能基因。候选基因的进一步验证非常必要,使用crispr/cas9技术进行单个基因敲除,通过筛选单克隆细胞构建候选基因敲除细胞系,在基因分型和免疫染色确认基因已被敲除后,确定其作用是否由基因敲除所致。


服务内容:
  1. cas9稳转细胞株的构建
  2. sgrna设计合成或者gecko v2双质粒系统sgrna文库扩增
3.单基因突变细胞群落筛选
4.药物处理
5.对照组和加药组基因组提取
6.测序文库构建
7.sgrna富集分析(mageckflute工具箱分析)
8.结题报告撰写




艾迪项目案例:

a549 cas9细胞sgrna文库稳转细胞库(cell pool)构建服务内容
  1. 前期技术咨询(免费);
  2. 细胞株抗生素敏感浓度摸索;
  3. a549细胞cas9稳转细胞株构建;
  4. sgrna设计合成(共2026条,4*504基因 10条对照sgrna);
  5. sgrna载体文库构建(覆盖度≥90%);
  6. sgrna载体文库质控测序;
  7. 文库sgrna补充构建(鉴于第一轮芯片合成仅能够保证≥90%的覆盖度,剩余的sgrna将进行单个合成,最终保证覆盖率100%);
  8. sgrna慢病毒文库包装;
  9. sgrna慢病毒文库滴度测定;
  10. a549细胞sgrna文库稳转细胞库筛选(由于存在一定比例的致死基因,因此筛选后sgrna的代表性和上面文库的覆盖度可能不一致)。
材料
  1. sgrna载体文库序列信息;
  2. sgrna文库载体(5-10 μg);
  3. a549细胞sgrna文库稳转细胞库(t25培养瓶,细胞不少于3x106;即每个sgrna的代表性约为1500个细胞;同时我司会保留一份等量备份细胞);
  4. 完整项目结题报告1份(pdf文件);
  5. 其他要求和客户协商交付

联系人:盖先生

地址:广州

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