单细胞转录组测序（10x）价格-博天堂备用
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云鸿医疗科技有限公司
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单细胞测序单细胞转录组测序（10x）
单细胞测序是一种高精度的基因组学技术，用于研究个体细胞的基因表达模式和遗传变异。
单细胞测序解决的根本问题：细胞间的异质性
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单细胞测序解决的根本问题：细胞间的异质性
一、数据质控和预处理
原始数据质控
单细胞测序完成后，对下机数据进行质量控制是数据分析的首要步骤，便于提高下游分析的准确性和效率。首先需使用 fastp 对原始数据进行质控，包括去除低质量 reads、修剪 adapter 序列、计算测序错误率等。fastp 前和 fastp 后用fastqc 检测数据质量合格性和效果。
数据预处理
高精精准医学10×genomics平台通常使用 cellranger进行文库拆分、细胞定量、组成分析和参数调整。
建库周期短：十几分钟内可完成上万个细胞封袋，一天内获得测序文库
细胞通量高：80000＋cells
双细胞率极低：< 0.9%/1000 cells
超高捕获效率：单细胞捕获率高达65%
性能参数优异，数据有效率高，灵活可靠
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二、细胞质控
数据预处理后，测序结果仍会受技术效应（批次效应、pcr 扩增偏好性、dropout events 等）或生物学效应（基因的随机表达、环境影响、周期影响等）等影响。为此需要进行细胞质控（cell qc）实现进一步的数据纠正，排除实验操作或测序过程中引入的噪音、偏差和错误，保证所有的 barcode 对应到质量合格的细胞。
低质量细胞过滤策略：
基因表达筛选：低质量细胞通常基因表达量较低。
细胞批次效应纠正：样本来源包含多个批次或实验条件，需经特殊算法进行批次效应的纠正。
线粒体基因的比例：线粒体基因是评估活体细胞生存水平的重要指标，通常低质量的细胞具有相对高的线粒体基因比例。
红细胞过滤：根据细胞的特定标记、群体密度、表达模式等信息，识别并排除潜在的异常细胞，例如红细胞污染等
周期基因质控：细胞周期的不同阶段会导致细胞内基因表达水平的差异，进而影响到单细胞测序的结果。
三、降维与聚类
单细胞数据降维的过程是对数据集基因进行过滤，仅保留部分对数据具有信息贡献的基因——高变基因（highly variable genes，hvg），根据任务和数据集的复杂性，选择合适的 hvg 用于下游分析。细胞降维聚类目的在于将同类型的细胞聚在一起，不同的细胞类型彼此分开，同时识别不同细胞类型之间的基因表达特征。降维通过线性降维（主成分分析，principal component analysis，pca）和非线性降维（umap 降维分析）来实现。降维有两个目标：可视化和信息汇总。
四、富集分析
富集分析主要是对基因进行功能或者通路的富集，以此来了解不同细胞类型或者细胞亚型间差异基因的生物学功能，借助软件 clusterprofiler 可以实现对差异基因的功能富集分析。
kegg 通路富集分析
kegg（kyoto encyclopedia of genes and genomes）是有关 pathway 的主要公共数据库，其中整合了基因组化学和系统功能信息等众多内容。信息分析时，我们将 kegg 数据库按照动物、植物、真菌等进行分类，依据研究物种的种属选择相应的类别进行分析。
go 功能富集分析
go（gene ontology）是描述基因功能的综合性数据，可分为生物过程（biological process）和细胞组成（cellular component）分子功能（molecular function）三个部分。go 功能显著性富集分析给出与基因集背景相比，在差异表达基因中显著富集的 go 功能条目，从而给出差异表达基因与哪些生物学功能显著相关。
gsea 富集分析
gsea（gene set enrichment analysis）是一种基因集富集分析的方法，传统的 kegg 或者 go 基因富集方法得到的通路中既有上调基因也有下调基因，无法可靠地比较实验组和对照组之间的同一通路的基因上调下调差异，而gsea 则较好地解决了这个问题。此外，gsva（gene set variation analysis）也是一种类似的基因集富集分析的方法。与 gsea 不同的是，gsea 需要提供实验组和对照组之间的差异基因，而 gsva 则不需要提供样本之间的差异基因，直接对基因表达矩阵进行分析。
五、细胞注释
singler 细胞类型初步定义
singler 是对单细胞转录组数据进行细胞类型自动注释的 r 包，它通过已知类型的细胞样本作为参考数据集，对数据集中与参考集相似的细胞进行标记注释。
singler 对每个细胞进行如下处理：
(1) 计算每个细胞的基因表达与参考细胞数据集表达谱之间的相关性
(2) 对每种细胞类型的得分进行计算并取固定分位数作为细胞类型得分
(3) 对所有的标签重复此操作，然后将得分最高的标签作为此细胞的注释
“marker genes”可视化
使用 seurat r包的 findallmarkers()得到不同聚类类群的差异基因信息，筛选不同聚类类群中上调表达的基因作为该聚类类群的 marker 基因。
筛选的指标：
（1）目标亚群或者对照的亚群中，基因在 10%以上的细胞中有表达
（2）p 值小于等于 0.01
（3）基因表达倍数 logfc 大于等于 0.20
六、拟时序分析
拟时序分析是一种用于模拟细胞之间发育过程的方法。细胞在分裂发育过程中，都处在状态转换的过程中，假设该过程产生的蛋白和代谢物是动态保守的，那么可以利用该连续发生的状态转换来模拟细胞动态变化的过程，即重建了分化轨迹。该分析适用于已知存在连续分化过程的样本，如骨髓中存在着从干细胞到成熟细胞的分化过程，因此适用于拟时序分析。但是分化成熟的样本，如 pbmc 样本则不适合使用拟时序分析。常用的拟时序分析软件是 monocle3。
七、细胞通讯分析
七、细胞通讯分析
细胞通讯分析可以帮助我们了解细胞与细胞之间的互作关系，解析细胞间通信网络。揭示发育过程中各类细胞的相互作用、探索肿瘤免疫微环境、挖掘疾病潜在的治疗靶点。 cellchat 能够可视化细胞与细胞之间的通讯关系，以便查看具有强烈通讯关系的细胞对，通过表格能够进一步查看通讯细胞之间的配体-受体作用关系。
八、转录因子预测
转录因子（transcription factors，tfs）是一类重要的蛋白质，它们通过与特定的 dna 序列（tfbs/motif）结合，来实现对基因的精确调控。这种调控包括改变染色质构象以影响 dna 的可访问性、募集 rna 聚合酶进行转录过程、募集辅助因子调节特定的转录阶段，调控诸多生命过程，如细胞分化、免疫应答、发育、细胞周期调控以及应激反应等。因此，分析转录因子表达及其调控活性对于解析复杂生命活动具有重要意义。
scenic（single-cell regulatory network inference and clustering）是目前进行单细胞转录因子分析的主流软件。它的原理是基于共表达和 dna 模基序（motif）分析，推断基因调控网络的结构和功能。scenic 通过筛选出调控强度显著且在细胞核心功能中发挥关键作用的转录因子（tfs），通常以热图的形式呈现分析结果。在癌症研究领域，scenic 分析具有重要的应用价值。它可以帮助找到与肿瘤的发生和发展密切相关的关键“驱动基因（driver）”，为深入探究肿瘤发病机制提供了基础。通过识别这些关键驱动基因，研究人员可以更好地理解肿瘤细胞的调控网络，从而为开发新的治疗策略和药物靶点提供重要线索。
九、cnv 分析
基因拷贝数变异（copy number variation, cnv）能进一步引起基因的沉默、高表达或序列突变，从而引起细胞癌变。所以，我们可以从单细胞的基因表达量变化预测基因 cnv 事件，并以 cnv 分布特征的差异性去区分肿瘤细胞，并且进一步探寻肿瘤细胞的异质性及肿瘤进化。
通常区分肿瘤细胞和正常细胞的有效方法是鉴定非整倍体拷贝数，因为在人类肿瘤中有 88%的肿瘤细胞特征都是非整倍体，而基质细胞等正常细胞是具有二倍体的基因组特征。因此，我们可以在单细胞分辨率下研究单细胞 cnv 分布特征，就可以识别肿瘤细胞。
copykat 将贝叶斯方法与分层聚类相结合，以计算单细胞的基因组拷贝数图谱，并根据高通量 3'scrna-seq 数据定义克隆亚结构。主要适用于分析来自高通量，低测序深度 scrna-seq 平台的数据（微滴和纳米孔平台）。能准确地根据其非整倍体拷贝数对肿瘤和正常细胞进行分类。
十、共表达网络分析
wgcna 全称加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis），是用来描述不同样品之间基因关联模式的系统生物学方法，可以用来鉴定高度协同变化的基因集，并根据基因集的内连性和基因集与表型之间的关联鉴定核心基因，从而鉴定候补生物标记基因或治疗靶点。然而传统的 wgcna 算法对于稀疏矩阵的敏感性相对较差，单细胞数据中固有的稀疏性和噪声会导致虚假的基因-基因相关性。hdwgcna 通过将高度相似的细胞折叠成“metacell”来减少稀疏性，同时保留细胞异质性，并允许模块化设计在特定细胞群中执行单独的网络分析，从而减少这些因素的影响。适用于推断、分析和解释高维转录组学数据中的基因共表达网络。
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